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琳琅qq飞车吧:雜交虎龍斑消化道枯草芽孢桿菌的特性及其作為益生菌的作用

出處:水生動物健康評估FSI 作者: 水產養殖網 2019-04-07 21:05:00
今天小編與大家分享一篇發表在Fish & Shellfish Immunology上的文章,雜交虎龍石斑魚胃腸道枯草芽孢桿菌的特性及其作為益生菌添加劑的作用,引用信息如下:
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抗生素的廣泛使用導致了對水生和人類健康有害的抗生素耐藥性。據報道,美國每年至少有200萬人遭受嚴重的抗抗生素細菌感染,超過23萬人死于這些抗抗生素細菌的感染。因而食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration)等部門限制了抗生素作為動物生長促進劑的使用。在這種情況下,應用益生菌可能是預防致病性感染的替代策略。
益生菌以許多積極的方式影響動物的健康,包括:(i)競爭性排除病原體,(ii)營養物質的產生和酶對消化的貢獻,(iii)抑制物質的分泌,(iv)增強免疫反應和(v)改善水質??薟菅挎吒司懿婦睪涂薟莞司?,可用于食品保存和控制食物中毒。據報道,在養殖水體中施用枯草芽孢桿菌可以提高水質,提高幼年凡納濱對蝦對哈維弧菌感染的抵抗力,從而獲得較好的生長性能。更重要的是,孢子往往在極端環境下具有很高的抵抗力,如胃液、膽汁和熱處理,這可能有利于喂養。

益生菌被廣泛用于改善動物的生長和健康。然而我國很少有海洋水生益生菌得到應用和許可。本研究從虎龍石斑魚胃腸道分離到一株芽孢桿菌屬菌株,鑒定為枯草芽孢桿菌新菌株,命名為7K??薟菅挎吒司?K具有良好的產孢能力,對加熱、模擬胃液和模擬十二指腸液都有很好的耐受性,表明其具有作為益生菌的潛力。我們在枯草芽孢桿菌7K的分泌物中發現了7種抗菌藥物,添加在飲食中可促進虎龍石斑魚的生長。此外,枯草芽孢桿菌7K能抑制虹彩病毒的感染,因為能夠作為維持魚類健康的適宜益生菌。我們的研究結果還表明,枯草芽孢桿菌7K在病毒感染下對虎龍石斑魚產生非特異性免疫反應。用含108和1010 CFU g-1枯草芽孢桿菌7K的飼料飼喂虎龍石斑魚4~8周,虎龍石斑魚的血清溶菌酶活性、血清補體活性(ACH50)、血清殺菌活性、呼吸爆發、超氧化物歧化酶活性(SOD)和頭腎白細胞吞噬活性均顯著增強。綜上所述,枯草芽孢桿菌7K是一種在石斑魚培養應用具有持久性、生長刺激性、增強免疫力和促進健康的益生菌。
本實驗首先從虎龍石斑魚胃腸道中篩選枯草芽孢桿菌。采集新鮮腸內容物樣本后,為了排除非產孢細菌,將1g樣品在無菌PBS緩沖液中稀釋1:100,在80℃加熱15 min。在4000 g條件下離心10 min 4℃后,將上清液加入LB培養基中,在37℃條件下培養24h。然后對培養基進行連續稀釋以獲得單克隆菌株。通過光學顯微鏡觀察菌落顏色、形態、大小,16s rDNA測序以及常規生理和生化鑒定確定菌株的分類。系統發育分析、生理生化特征表明,分離株7K為枯草芽孢桿菌。隨后將0,106、108和1010 cfu g- 1的枯草芽孢桿菌7K作為飼料添加劑喂養石斑魚0-8周,主要實驗結果如下:

1.細菌生長曲線
在自發酵罐中生長30小時后,枯草芽孢桿菌7K的生長進入穩定期,產孢率在48 h達到峰值(95%以上);搖瓶發酵過程中,枯草芽孢桿菌7K在18 h進入穩定期,營養細胞數在36 h開始快速下降,產孢率在33 h達到最高點(接近20%)。
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2.耐熱性和模擬Git條件的測定            
通過在沸水浴中處理菌株獲得了存活曲線??薟菅挎吒司?K的孢子經100 ℃加熱2 min后,其存活率略有下降,表現出較高的耐熱性;枯草芽孢桿菌7K的營養細胞經30 s熱處理后存活率急劇下降,大腸桿菌也對熱敏感,100 ℃熱處理60 s后沒有細胞存活。
在模擬胃液條件下,枯草芽孢桿菌7K的孢子數在第1 h的減少量小于5%。對枯草芽孢桿菌7K的營養細胞和大腸桿菌進行了相同的實驗,細菌數量急劇減少,但是枯草芽孢桿菌7K的營養細胞對模擬胃液的耐受性顯著優于大腸桿菌(p<0.05)。
在模擬十二指腸液中培養3 h,枯草芽孢桿菌7K的孢子表現出較高的耐受性,存活率接近100%。然而,枯草芽孢桿菌7K的營養細胞從6.43 log CFU ml−1下降到1.56 log CFU ml−1,顯示出對模擬十二指腸液的高敏感性。大腸桿菌在模擬十二指腸液中的數量是穩定的,這表明大腸桿菌對模擬十二指腸液有耐受性。 
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3.細胞外抗菌試驗
枯草芽孢桿菌7K的細胞外抗菌活性測定結果見表1??薟菅挎吒司?K發酵液上清液可形成抑制區,并具有胞外抗菌活性。在6種病原菌中,上清液對金黃色葡萄球菌、溶藻鐮刀菌、溶血病弧菌和哈維弧菌均有抗菌作用,但對嗜水菌和外陰弧菌的抗菌作用較小。根據LC-HRMS分析,上清液中有7種主要物質(S1-S7)可能有助于抗菌效果。
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4.枯草芽孢桿菌7K促進石斑魚生長
實驗結果如表2所示。實驗開始時,食用益生菌補充飲食和對照飲食的石斑魚的體重沒有顯著差異(p>0.05)。28天后,添加106、108和1010 cfu g- 1  枯草芽孢桿菌7K補充飲食組和對照組的石斑魚在最終體重、增重、ADG, PWG和 FE 方面存在顯著差異(p<0.05)。以106、108和1010 cfu g- 1 枯草芽孢桿菌7K補充飲食喂養的魚在最終體重、增重、ADG, PWG和 FE 方面沒有顯著差異。益生菌補飼與對照組的存活率無顯著性差異(p<0.05)。
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5.枯草芽孢桿菌7K的?;ぷ饔貿始亮懇覽敵?br> 通過浸泡感染SGIV,在第3天之前,添加108和1010 cfu g-1 枯草芽孢桿菌7K補充飲食的魚中未觀察到死魚。感染后10天,與對照組(73.33±5.77%)相比,108(46.67 ±11.55%)和 1010 cfu g-1(30± 0%)益生菌補充飲食的魚的累積死亡率存在顯著差異。此外,感染后10天,采用1010 cfu g-1益生菌補充飲食喂養的魚的死亡率明顯低于采用108和106 cfu g-1飲食喂養的魚類(60.00±10.00%)。然而,采用106 cfu g-1飲食的魚類與對照飲食的死亡率沒有顯著差異。
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6.石斑魚免疫相關基因的表達        
 在0、106、108和1010  cfu (g diet)−1 條件下,經SGIV處理48小時后,食用枯草芽孢桿菌7K的組未觀察到死魚。108添加組魚的MXⅠ, MXⅡ和ISG15 三種干擾素相關基因的表達水平明顯高于對照組和106添加組。108添加組魚MXⅠ和ISG15 的表達水平明顯低于1010添加組。106和對照組魚相比,只有ISG15的表達水平沒有顯著差異。
三種促炎細胞因子IL-1β、IL-8和TNFα在108和1010 添加組中的表達水平明顯高于0、106組,在感染病毒48小時后,1010 添加組IL-8的表達水平明顯高于明顯0 cfu g−1添加組。值得注意的是,1010 添加組IL-1β的表達水平顯著高于108 添加組,但TNFα的表達顯著低于食用108 添加組。
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7.飼料中添加枯草芽孢桿菌7K的石斑魚的非特異性免疫參數  
在養殖的0-8周中,與對照組石斑魚相比,106、108和1010  cfu (g diet)−1 組石斑魚的溶菌酶活性、呼吸爆發、ACH50、SOD活性、石斑魚血清殺菌活性、頭腎白細胞吞噬活性均有不同程度的增高,且部分參數呈劑量依賴性。
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小結:
綜上所述,本研究表明,從石斑魚中分離得到枯草芽孢桿菌7K具有良好的抗性,并且具有潛在的益生菌的產孢能力??薟菅挎吒司?K的分泌物中含有多種抗菌物質,其顯著的促生長作用以及對病原微生物感染的抑制作用使其成為一種有前途的益生菌。結果還表明,枯草芽孢桿菌7K對石斑魚的非特異性免疫反應有較好的促進作用,并可增加病毒感染時的免疫相關基因表達。總之,枯草芽孢桿菌7K是一種可用于水產養殖的有效的益生菌。


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